近年來，全球藥物研發與生命科學研究迎來關鍵變革。2025年美國FDA正式官宣政策革新，逐步取消單抗藥物安全性評估的強制動物實驗要求，全力鼓勵類器官（Organoid）、3D細胞球狀體（3D Spheroid Culture）等非動物替代模型（NAMs）的臨床前應用。這一政策落地，讓長期受限于2D培養缺陷的肝臟研究迎來破局契機。肝臟作為人體核心代謝、解毒器官，其生理功能高度依賴復雜的三維空間結構與細胞交互作用。傳統2D單層肝細胞培養模式，強行將細胞平鋪于培養基底，徹-底破壞體內天然微環境，導致肝細胞快速去分化、CYP450代謝酶活性驟降、白蛋白分泌功能丟失。

原代肝細胞3D成球（3D Spheroid Culture）培養技術，通過細胞自組裝形成立體球狀體，高度模擬肝臟體內三維結構、細胞交互與代謝特征，有效解決2D模型預測偏差大、功能維持短的痛點，成為肝臟疾病機制研究、藥物肝毒性篩查、再生醫學研究的黃金模型。但不少科研團隊在實操中面臨難題：成球不均、球體易散、功能維持時間短、批次差異大、培養基適配性差……優質3D肝球模型的構建，絕非簡單的細胞堆疊，而是培養耗材+專屬培養基+標準化流程的系統化協同。

IPHASE作為體外研究生物試劑引-領者，可為大家提供全套肝細胞3D成球專屬解決方案，以U底超低吸附培養板（Ultra-Low Attachment U-Bottom Culture Plate）、專用細胞復蘇培養基（General Hepatocyte Thaw Medium）、3D成球培養基（Hepatocyte 3D Spheroid Formation Medium）、3D維持培養基（Hepatocyte 3D Spheroid Maintenance Medium）四大核心產品為支撐，搭配標準化操作流程，輕松構建形態均一、功能穩定、生理相關性高的3D肝球模型，全-方位適配多場景科研需求。

01    肝臟體外研究的前沿利器：肝細胞3D成球培養及應用

球狀體培養是一種初代三維細胞培養（3D Cult-ivation，3D培養）技術，是由原代細胞或癌細胞系在培養過程中自組裝成簡單的球形或多細胞聚集體，保留了三維結構和組織特異性。球狀體培養相對簡單，通過超低粘附培養、懸滴培養、磁化細胞培養等技術，原代細胞可以不依賴細胞外基質Extracellular Matrix（ECM），僅通過相互作用自然聚集形成直徑高達150-175µm的球狀團聚體。與傳統的二維單層細胞培養相比，球狀體培養能夠更真實地反映細胞在體內的生理特性，適合腫瘤生物學研究和高通量藥物篩選分析。

肝臟作為人體最大的代謝器官，其功能實現高度依賴肝細胞與周圍細胞、細胞外基質形成的復雜空間網絡。傳統2D培養將肝細胞平鋪于培養皿，破壞了這種天然交互關系，導致肝細胞在培養5天內就會發生去分化，喪失CYP450代謝酶活性、白蛋白分泌等核心功能，無法真實反映體內藥物代謝與毒性反應規律。

相比之下，肝細胞3D成球培養（3D spheroid culture）通過細胞自聚集形成立體結構，高度模擬了體內肝臟的微環境特征，展現出三大不可替代的優勢：

（一）首先，功能維持更持久。3D肝球中的肝細胞通過細胞-細胞、細胞-基質間的緊密作用，可將核心功能維持21天以上，部分HepaRG細胞系形成的球體存活甚至超80天，遠超2D培養的功能周期，為長期藥物暴露、疾病進展等研究提供了可能。

（二）其次，生理相關性更高。肝球內部形成的缺氧梯度、竇狀樣結構，能精準模擬體內肝臟的生理微環境，使肝細胞的白蛋白分泌、膽汁生成、藥物代謝等功能更貼近體內真實狀態，顯著提升藥物毒性預測的準確性。

（三）最后，應用場景更廣泛。無論是藥物肝毒性篩查、病毒性肝炎機制研究，還是非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝纖維化等病理模型構建，3D肝球都能提供更可靠的實驗數據，解決2D模型預測偏差大的痛點。

憑借高生理相關性優勢，3D肝球模型已在多個研究領域實現突破，成為科研與產業轉化的核心工具。

(1) 在藥物研發領域，3D肝球大幅提升了藥物肝毒性預測的準確性。傳統2D模型因功能丟失，常導致潛在肝毒性藥物漏篩，而3D肝球可模擬藥物長期暴露效應，精準檢測藥物代謝中間產物的毒性，降低臨床試驗風險。例如在某抗結核藥物的肝毒性評估中，3D肝球模型成功檢測出2D模型未發現的慢性肝損傷風險，為藥物劑量優化提供了關鍵數據。

(2) 在肝臟疾病機制研究中，3D肝球可復刻病理微環境。通過使用疾病供體的原代肝細胞構建3D肝球，能模擬NASH、肝纖維化等疾病的病理狀態，助力解析疾病進展過程中的細胞交互機制。研究發現，在肝纖維化3D模型中，肝細胞與肝星狀細胞的共培養可重現膠原沉積過程，為抗纖維化藥物篩選提供了更貼近臨床的模型。

(3) 在再生醫學領域，3D肝球與生物打印技術的結合展現出巨大潛力。以色列科研團隊利用患者自身干細胞分化的肝細胞構建3D肝球，通過生物打印機逐層構建含血管網絡的完整肝臟，成功完成移植手術，術后24小時患者肝功能指標恢復正常，為解決器官短缺與免疫排斥問題提供了新方案。

02    核心剛需：為什么3D肝球培養必須用專屬體系？

不同于普通細胞培養，原代肝細胞3D成球對培養環境要求極-高，常規耗材與通用培養基完-全無法滿足需求：

1. 結構適配剛需：普通培養板粘附性強，肝細胞會平鋪貼壁，無法聚集形成立體球體；唯有超低吸附材質+U底結構，才能引導細胞自主聚集、均勻成球。

2. 細胞活性剛需：原代肝細胞活性脆弱，普通復蘇培養基易導致細胞滲透壓失衡、凋亡率高，直接影響后續成球效率。

3. 功能維持剛需：成球前期需要專屬培養基助力細胞聚集成型，后期需要維持培養基穩定細胞代謝功能，單一培養基無法兼顧“成球成型"與“長期功能保留"。

基于以上痛點，IPHASE打造一站式閉環3D成球體系，四大核心組件精準分工、高度適配，從源頭規避成球失敗、模型失效、數據偏差等問題。

 ① 核心載體：U底超低吸附培養板，打造均勻成球基礎：成球均勻度、完整性的關鍵核心，直接決定3D肝球模型質量。

IPHASE U底超低吸附培養板（Ultra-Low Attachment U-Bottom Culture Plate）（Cat NO. 0193601.21/ 0193601.22）采用特殊改性超低吸附材質，徹-底杜絕細胞貼壁現象；專屬U型底結構可精準聚攏細胞，配合短時離心處理，讓細胞快速聚集于孔底中心，單次即可形成大小均一、形態規整、結構致密的肝球，杜絕散球、畸球、大小不一等問題。

【產品優勢】

? 超低吸附涂層穩定無脫落，無細胞粘附干擾，無需細胞接種前洗板，即開即用，操作更簡便

? U底弧度精準優化，適配3000-5000個/孔最-優接種密度，成球成功率高

? 無菌獨立包裝，批次穩定性強，適配高通量藥物篩選與批量實驗

? 多規格可選：96孔U底專屬成球板，同時配套平底6/12/24/48/96孔板，滿足不同實驗場景

 ② 活性保障：專用肝細胞復蘇培養基，守住細胞活性第一道關：原代肝細胞復蘇環節的活性損耗，是很多實驗開局翻車的隱形原因。普通培養基復蘇易出現細胞腫脹、破裂、活性下降，導致后續成球稀疏、球體易碎。

IPHASE肝細胞專用復蘇培養基（Cat NO. 0193311.11/0193301.13）為原代肝細胞專屬配比，精準調控滲透壓、營養因子與緩沖體系，快速適配凍存細胞復蘇后的環境變化，最大限度降低離心、溫度波動帶來的細胞損傷，有效提升細胞活率與貼壁/成球潛能。

【產品優勢】

? 預配完整體系，無需自行配比，開瓶預熱即可使用，減少人為誤差

? 適配人、猴、犬、大鼠、小鼠全種屬原代肝細胞，通用性強

? 有效提升復蘇后細胞活率，為后續均勻成球、功能表達筑牢基礎

③ 成型關鍵：3D球狀體成球培養基，助力快速規整成球: 細胞復蘇接種后，前期聚集成型是3D培養的核心步驟。普通培養基缺乏成球專屬營養配比，易出現細胞聚集緩慢、球體松散、空心解體等問題。

IPHASE 3D球狀體成球培養基（Hepatocyte 3D Spheroid Formation Medium）（Cat NO. 0194101.13）專為肝細胞自組裝成球優化配方，精準調控細胞粘附、聚集相關因子，無需基質膠輔助，即可引導肝細胞自主有序聚集，4-7天左右即可形成結構完整、致密均勻的成熟肝球。培養基可完-美適配U底超低吸附板體系，全程無需換液、無需頻繁觀察，最-大-程度避免外力干擾球體成型，大幅提升實驗穩定性。

 ④ 功能續航：3D球狀體維持培養基，長期保留體內生理功能：成球成型并非實驗終點，功能穩定維持才是3D模型優于2D模型的核心價值。成球初期完成后，切換專屬維持培養基，可精準維系肝細胞核心生理功能。

IPHASE 3D球狀體維持培養基（Hepatocyte 3D Spheroid Maintenance Medium）（Cat NO. 0194101.21）針對性優化代謝營養配比，可有效維持肝球白蛋白分泌、CYP450藥物代謝酶表達、膽汁生成等核心功能，功能穩定周期經驗證可達至少21天。經qPCR分子驗證與蛋白功能檢測，使用該培養基維持的3D肝球，ALB、CYP450等核心基因持續高表達，生理相關性高度貼合體內肝臟狀態，滿足長期藥物毒性篩查、疾病進展機制研究、病理模型構建等高-端實驗需求。

03    3D球狀體培養（3D Spheroid Culture）流程

優質3D肝球的形成，離不開“細胞選擇-培養體系-操作流程"的協同適配。IPHASE作為體外研究生物試劑引-領者，從原代肝細胞（Primary hepatocytes）、培養體系到試驗耗材，把握關鍵關卡，篩選關鍵參數，最終形成穩定、適用的3D成球肝細胞。下面以猴原代肝細胞為例，詳細描述IPHASE猴肝細胞3D成球培養流程及結果驗證。

（一）猴原代肝細胞的復蘇從液氮罐中取出猴原代肝細胞凍存管，擰松 1/4 管蓋釋放壓力，迅速擰緊并轉移到 37℃的水浴中，順時針輕柔搖動 90~120 s，至凍存管中只有小塊碎冰漂浮即可。從水浴鍋中取出凍存管，用 75%酒精對凍存管表面進行消毒，轉移至生物安全柜中。用巴氏吸管將細胞懸液吸出，緩慢滴加至裝有 37℃預熱的 IPHASE General Hepatocyte Thaw Medium（Cat. 0193311.11） 的無菌15 mL 離心管中，并使用IPHASE General Hepatocyte Thaw Medium（Cat. 0193311.11）潤洗凍存管 2~3 次，輕微顛倒混勻。注：保持凍存管蓋始終處于水浴鍋液面以上，以防造成細胞污染。

設置離心力 100 g，4 ℃離心 5 min后，充分吸棄上清，切勿接觸到細胞沉淀。 用IPHASE Hepatocyte 3D Spheroid Formation Medium（Cat. 0194101.13）重懸細胞沉淀。臺盼藍染色計數細胞活率。

（二）猴原代肝細胞的3D球狀體培養

（1）細胞濃度調整：采用 IPHASE Hepatocyte 3D Spheroid Formation Medium（Cat. 0194101.13）培養基將細胞懸液濃度調整至 1.5×10^4 cells/mL~2.5×10^4 cells/mL，輕柔吹打混勻，確保細胞濃度均勻一致。

（2）接種：向 IPHASE Ultra-Low Attachment surface,Plates,U Bottom,96well,Sterile (Cat NO. 0193601.21/ 0193601.22)中每孔接種 200μL 細胞懸液，每孔肝細胞數量控制在 3000~5000 cells，接種過程中避免產生氣泡，確保每孔接種量均勻。

（3）離心聚集：將接種完成的 U 型底超低吸附培養板放入水平離心機，設置轉速為 250g，在室溫條件下離心 10 分鐘，使肝細胞聚集于孔底部，以促進球狀體形成。

（4）培養：輕柔將培養板轉移至提前校準完畢的二氧化碳培養箱（37℃、5%二氧化碳、相對濕度≥95%）中，靜置培養 4~7 天即可形成穩定的肝細胞球狀體，培養期間無需更換培養液。

注：培養過程中嚴禁晃動培養板，防止肝細胞球狀體分散；需定期觀察培養情況，避免培養液干涸。

（三）猴原代肝細胞3D球狀體的維持與后續試驗

（1）球狀體維持：肝細胞球狀體形成后，可將培養板中的 IPHASE Hepatocyte 3D SpheroidFormation Medium 更換為 IPHASE Hepatocyte 3D Spheroid Maintenance Medium（Cat NO. 0194101.21），后續每2~3 天更換一次新鮮的維持培養基，以確保球狀體的穩定生長與功能維持。

注：更換培養基時操作需輕柔，槍頭靠壁緩慢釋放培養液，避免沖擊肝細胞球狀體導致其破裂。

（2）后續實驗：維持培養期間，為證明IPHASE 原代肝細胞3D球狀體培養技術的成功，IPHASE技術人員以相同的復蘇、成球培養流程，同時培養了K0125E086批次食蟹猴原代肝細胞、B0125H018批次比格犬原代肝細胞及SD大鼠原代肝細胞，并考察、驗證了其球狀體培養7天后上清中白蛋白的分泌情況（下圖1）。此外，為更好的考察培養天數對白蛋白分泌的影響，IPHASE技術人員同期將K0125E022批次猴球狀體肝細胞延長培養至21天，并對其進行檢測（下圖2）。

注：肝細胞球狀體為三維細胞團，實驗操作過程中需格外輕柔，避免因機械損傷導致球狀體解體。

圖1 不同種屬肝細胞球狀體白蛋白分泌情況

圖2 同批次猴肝細胞球狀體培養不同天數白蛋白分泌情況（球狀體培養7天、21天）

此外，3D 球狀體培養的核心優勢是維持肝細胞功能穩定性，而 qPCR（實時熒光定量 PCR）的驗證，即實現了從分子層面量化到細胞功能層面的目標，確保了3D 模型生理相關性與可靠性。IPHASE技術人員即以猴球狀體肝細胞為樣本，驗證了培養14天后ALB（白蛋白）、部分CYP40酶等相關基因的表達。成功表明了IPHASE猴3D球狀體肝細胞體系保留了肝細胞的核心生理功能，更貼近體內真實狀態。

圖3 猴肝細胞球狀體培養14天相關基因qPCR結果

04    IPHASE 產品

綜上所述，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領者，為滿足市場對類器官（Organoid）3D球狀體培養（3D Spheroid Culture）發展的高需求，現已逐步研發、生產出具有高活性、高純度且批次間差異小的原代肝細胞（Primary Hepatocytes），包含人原代肝細胞（Primary human hepatocytes）、猴原代肝細胞（Primary Monkey hepatocytes）、犬原代肝細胞（Primary dog hepatocytes）、大鼠原代肝細胞（Primary rat hepatocytes）、小鼠原代肝細胞（Primary mouse hepatocytes）等核心材料，并配有完-善復蘇培養基（ General Hepatocyte Thaw Medium）、肝細胞3D成球培養基(Hepatocyte 3D Spheroid Formation Medium)、肝細胞3D球狀體維持培養基（Hepatocyte 3D Spheroid Maintenance Medium）及U底超低吸附培養板（Ultra-Low Attachment U-Bottom Culture Plate）等試劑耗材，為藥物研發、肝臟疾病機制研究及再生醫學領域研究等多領域解鎖了技術研究新可能！